在ELISA試劑盒當中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其間包含：
1. 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方法可所以凹孔平板、試管、珠粒等�，F在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在運用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，調查其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附功能是否良好。
2. 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有必定影響,一般多選用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被后，在其它實驗條件相一同，調查陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量最少的濃度。關于多數蛋白質來說一般為1～10μg／ml。
3. 酶符號抗體作業濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行開始效價的滴定(見酶符號抗體部份)。然后再固定其它條件或采納“方陣法”(包被物、待檢樣品的參閱品及酶符號抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里準確地滴定其作業濃度。
4. 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體有潛在的致癌作用，應留意防護。有條件者應運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現在較為滿意的供氫體。ELISA試劑盒底物作用一段時間后，應參與強酸或強堿以停止反應。一般底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物運用液有必要新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前參與。
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