雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
1、將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2、加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。 洗滌除去其他未結合物質。
3、加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合 的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4、 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。
在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、 AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相 載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標 抗體結合，而不再形成夾心復合物。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應 后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同。
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